Иммунофенотипирование острых лейкозов
Иммунофенотипирование клеток – это определение поверхностных маркеров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Это метод, основанный на реакции антител с антигенами и используемый для определения специфических типов клеток в образцах крови, костного мозга, лимфатических узлов или других тканей. К антителам, которые реагируют со специфическими антигенами клеток, присоединена особая флюоресцентная метка, которая обнаруживается при помощи проточных цитометров или люминесцентных микроскопов.
Иммунофенотипирование с использованием метода проточной цитометрии имеет преимущества перед использованием других методов за счет большей точности, скорости, возможности одновременной регистрации нескольких антигенов на одной клетке. В настоящее время иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга является "золотым стандартом" в диагностике иммунодефицитов, лимфопролиферативных, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.
Целью исследования явилось обобщение данных, полученных при иммунофенотипировании острых лимфобластных (ОЛЛ) и миелобластных лейкозов (ОМЛ) с 2007 по 2010 гг.
Материалы и методы исследования
Было обследовано 612 детей за период с 2007 по 2011 год. Иммунофенотипирование опухолевых клеток костного мозга с помощью проточной цитометрии проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител (МАТ) фирмы Becton Dickinson (USA).
Подготовка проб: Во все пробирки вносили 50 мкл костного мозга. Затем добавлялись поверхностные антитела по 20 мкл. Панель маркеров, используемая для диагностики острых лейкозов: G1/G2/CD45, CD10/CD19/CD45, CD34/CD14/CD45, CD22/CD13/CD45, CD7/ CD117/CD45, CD20/CD33/CD45, HLA-DR/CD34/CD45, CD5/CD3/CD45, CD4/CD8/CD45, CD2/CD11c/CD45, CD41a/CD61/CD45, CD15/CD56/CD45, CD38/GlyA/CD45, Kappa/Lambda/ CD45, TdT/CD79a/CD45, cyIgM/МРО/CD45. Перемешивали на Vortex. Инкубировали в темноте в течение 15 минут. Добавляли 1 мл Lysing solution (Becton Dickinson, USA). Инкубировали в темноте 10 минут. Перемешивали на Vortex. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Добавляли 1000 мкл Permeafix (Becton Dickinson, USA). Перемешивали на Vortex. Инкубировали в темноте 30 минут. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Добавляли 1000 мкл Facs Flow (Becton Dickinson, USA). Перемешивали на Vortex. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Для выявления цитоплазматических маркеров: добавляли цитоплазматические антитела по 2,5 мкл. Инкубировали с антителами в темноте – 15 минут. Добавляли 1000 мкл Facs Flow (Becton Dickinson, USA). Перемешивали на Vortex. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Добавляли 500 мкл Facs Flow. Перемешивали на Vortex. Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA) в программе CellQuest.
При математической обработке полученных результатов использовали корреляционный анализ, определение доверительных интервалов. Для сравнения средних величин в процессе статистической обработки полученных данных использовали вычисление критерия достоверности разницы (t-критерий Стьюдента). Различия признавали статистически значимыми при р<0,05. Для статистической обработки полученных результатов использовали компьютерную программу Biostat.
Результаты исследования и их обсуждение
1. Структура иммунологических вариантов острых лейкозов
Проанализировано иммунофенотипирование острых лейкозов в Научном центре педиатрии и детской хирургии за период с 2007 по 2011 годы, в течение которого было проведено 715 иммунофенотипирований. Из них 103 больных (14,4%) поступили с рецидивами заболевания. Далее рассматриваются только первичные варианты иммунофенотипирования.
Рисунок 1.
Структура иммунологических вариантов острых лейкозов
<!--TEnd-->Наибольшее количество лейкозов пришлось на долю лимфобластных лейкозов - 70,5% (345 больных) (рис. 1). Нелимфобластные острые лейкозы составили 26,4% (129 больных). Бифенотипические варианты острых лейкозов составили 3,1% (15 больных).
Рисунок 2.
Частота выявления различных фенотипических вариантов
<!--TEnd-->Среди лимфобластных лейкозов основную долю заняли В-линейные острые лейкозы, которые составили 62,4% (305 больных), 26,4% пришлось на долю острых миелобластных лейкозов (129 больных) (рис. 2). У 40 больных (8,2%) был выявлен Т-лимфобластный лейкоз. На долю бифенотипических лейкозов пришлось 3,1% (15 больных).
Фенотип common-B варианта (В2) составил наибольшую группу 48,9% (239 больных) среди В-лимфобластных лейкозов. 4,1% (20 больных) составили больные из группы с про-В вариантом острого лимфобластного лейкоза (В1), с пре-В вариантом – 9,2% (45 больных). Один случай зрелого варианта ОЛЛ - В4 (0,2%).
Среди ОМЛ наиболее часто встречались варианты острых миелобластных лейкозов с созреванием и без созревания, которые мы отнесли в одну группу. Они составили 15,1% (74 больных). Далее 4,5% (22 больных) пришлось на долю острых промиелоцитарных лейкозов, миеломоноцитарные и моноцитарные лейкозы (М4-М5) составили 3,9% (19 больных), самая малочисленная группа недифференцированных лейкозов (М0) - 2,7% (13 больных). На долю бифенотипических острых лейкозов пришлось 3,1% (15 больных).
2. Уровень экспрессии антигенов при различных вариантах острых лейкозов
Основными маркерами в фенотипе В-линейных острых лейкозов являлись CD19, HLA-DR, CD79a, которые экспрессировались при всех подвариантах В-ОЛЛ (табл. 1). CALLA-антиген CD10 экспрессировался одинаково при В2-, В3-подвариантах ОЛЛ, и отсутствовал при В1-, В4-вариантах. Уровень экспрессии поверхностного антигена CD22 увеличивался в зависимости от «иммунологической зрелости» лимфобластов, а CD34, наоборот, уменьшался. Все это соответствует общепринятым критериям иммунофенотипической диагностики острых лимфобластных лейкозов и этапности процесса созревания гемопоэтических клеток-предшественников [5].
Основные маркеры, уровень экспрессии которых был наиболее высоким при Т-лимфобластных острых лейкозах, мы отнесли в одну группу: CD7, CD2, CD5, CD3, CD8, CD4. Маркеры перечислены в порядке убывания степени экспрессии.
При анализе миелобластных вариантов острых лейкозов наблюдалось увеличение экспрессии «раннего» миелоидного маркера CD117 от М0-недифференцированного варианта ОМЛ к стадиям дифференцировки М1-М2, а затем резкое снижение его экспрессии. Уровень экспрессии «якорного» маркера CD33, наоборот, увеличивался. Скачкообразными были изменения экспрессии таких антигенов, как CD11c, CD15, а также внутриклеточной миелопероксидазы (МРО).
Уровень экспрессии «неродственного» лимфоидного маркера CD19, был наиболее высоким при М0-недиференцированном варианте ОМЛ, снижался по мере возрастания «иммунологической зрелости» вариантов.
3. Частота встречаемости неродственных антигенов при острых лимфобластных лейкозах
Влияние коэкспрессии миелоидных маркеров на клинико-гематологические и прогностические особенности острых лейкозов у детей является предметом дискуссий (3, 6). Оценка прогностической роли неродственных (линейно-неспецифических) миелоидных маркеров на лимфобластах достаточно разноречива. Некоторые авторы связывают коэкспрессию миелоидных маркеров с неблагоприятным прогнозом, другие считают, что этот процесс не влияет на прогноз (2, 3).
Наибольший процент случаев составили не «чистые» варианты острых лимфобластных лейкозов, а с коэкспрессией неродственных антигенов (табл. 2). При анализе встречаемости миелоидных антигенов при В-линейных субвариантах острых лейкозов (по горизонтали), достоверно чаще встречалась коэкспрессия CD13, CD33, CD15-антигенов при В1, В2 и В3-вариантах ОЛЛ. Также, довольно часто встречалась коэкспрессия внутриклеточного маркера МРО.
При анализе выявляемости миелоидных маркеров среди подвариантов острых лимфобластных лейкозов достоверной разности в коэкспрессии выявлено не было. Однако, при В1 и В2 подвариантах чаще выявлялась коэкспрессия CD13, CD15, CD33, антигенов, а также МРО. Среди пре В- вариантах ОЛЛ – CD15, CD13, CD33. Только среди В2-подвариантах ОЛЛ встречалась коэкспрессия CD14-, CD2-антигенов. В случае единственного установленного зрелого В-варианта ОЛЛ была выявлена коэкспрессия цитоплазматического маркера МРО.
При изучении коэкспрессии Т-лимфобластных лейкозов, которые были выделены нами в одну группу, очевидно, что коэкспрессия миелоидных маркеров встречалась только в половине процентов случаев. Достоверно чаще встречалась коэкспрессия CD13-антигена и МРО.
4. Частота встречаемости неродственных антигенов при острых миелобластных лейкозах
При анализе частоты выявления лимфоидных антигенов при миелобластных лейкозах, коэкспрессия неродственных маркеров достоверно не отличалась при различных вариантах острых миелобластных лейкозов. Наибольшую долю при всех миелоидных подвариантах лейкозов составила коэкспрессия антигена CD19, причем, при ранних вариантах ОМЛ (М0, М1-М2) она была выше, чем при М3, М4-М5 вариантах. Следующей по частоте была коэкспрессия лимфоидного антигена CD4, которая возрастала с ростом дифференцировки бластов (от М1-М2 к М4-М5 вариантам). Наиболее редкой была коэкспрессия лимфоидных маркеров CD2, CD5, CD7, CD79a, CD3. При этом надо отметить, что иммунофенотипы имели коэкспрессию одного, двух и более неродственных маркеров в различных сочетаниях.
<!--TEnd-->
<!--TEnd-->5. Коэкспрессия антигенов при различных вариантах острых лимфобластных лейкозов
В результате наших исследований в 2/3 случаев были выявлены бластные клетки, имеющие на своей поверхности и/или в цитоплазме антигены, присущие различным гемопоэтическим линиям (рис. 3).
Рисунок 3.
<!--TEnd-->В случае лимфобластных лейкозов коэкспрессия миелоидных антигенов была выявлена в 69,9± 2,5% (241) случаев.
Частота коэкспрессии миелоидных антигенов на лимфобластах (рис. 4) была различной в зависимости от варианта. Так, при В1-варианте ОЛЛ она составила 75,0% (24), при В2 – 77,2% (274), при В3 – 75,8% (47), при Т – 48,9% (23).
Рисунок 4.
<!--TEnd-->В случае миелобластных лейкозов (рис. 5) коэкспрессия лимфоидных антигенов была выявлена в 73,6% (95 случаев). «Чистых» вариантов без коэкспрессии было 26,4% (34). Частота коэкспрессии лимфоидных антигенов на миелобластах была различной в зависимости от варианта. Так, при М0-варианте она составила 82,4% (14), при М1-М2 – 84,4% (81), при М3-85,5% (19), при М4-М5 – 75,0% (18).
Рисунок 5.
Коэкспрессия лимфоидных антигенов при различных вариантах ОМЛ.
<!--TEnd-->6. Средняя интенсивность флюоресценции
Оценка иммунофенотипического профиля трансформированных клеток является одним из базовых компонентов диагностики онкогематологических заболеваний (4). Каждый из определяемых с помощью МАТ клеточных антигенов характеризуется своим значением средней интенсивности флюоресценции (СИФ), который зависит от стадии дифференцировки клеток, специфичности экспрессии линейно-рестриктированных антигенов на клетках «своей» или «чужой» линии (1), а также от типа флюорохрома, компенсаций и настроек цитометра.
Средняя интенсивность флюоресценции миеломаркеров CD14, CD13, CD117, CD33, MPO гораздо выше при специфической экспрессии при ОМЛ, чем выявляемых в качестве коэкспрессии при ОЛЛ (табл. 3). Аналогично, средняя интенсивность флюоресценции лимфомаркеров CD19, CD10, CD22, CD20 выше на бластных клетках ОЛЛ, чем ОМЛ. Надо отметить, что средняя интенсивность флюоресценции HLA-DR и CD34 гораздо выше при ОМЛ, чем при ОЛЛ.
<!--TEnd-->В таблице 3 представлены СИФ различных маркеров при подвариантах ОЛЛ и ОМЛ. Пан-В-клеточный маркер CD19 характеризовался наиболее высокой степенью интенсивности флюоресценции на лейкозных клетках при пре-B-вариантах ОЛЛ. CD10-антиген имел наибольшую СИФ при common-B-варантах ОЛЛ, наиболее низкую – при про-В-вариантах ОЛЛ. СИФ В-линейного маркера CD20, а также молекулы HLA-DR резко увеличивался по мере повышения дифференцировки бластных клеток. СИФ стволовоклеточного маркера CD34 резко снижалась от В1 к В3-подвариантам ОЛЛ.
СИФ миеломаркеров при различных подвариантах ОЛЛ (CD13, CD15, CD33, CD11c, MPO) был наиболее высоким при common-B вариантах ОЛЛ. В случаях ОМЛ, СИФ «ранних» антигенов CD117, CD34 наиболее высокой была при подвариантах М1-М2, а СИФ маркеров CD11c, CD15, CD14 - при М4-М5- подвариантах ОМЛ. СИФ лимфоидного маркера CD19 была наиболее высокой при М4-М5-подвариантах ОМЛ.
Выводы
- В структуре иммунологических вариантов ОЛ детей РК за период с 2007 по 2010 г.г. с большей частотой (70,5%) встречается острый лимфобластный лейкоз, а среди лимфобластных - common-вариант (В2) - в 48,9% случаев
- При ОЛЛ в 69,9±2,5% выявлена коэкспрессия миелоидных антигенов. Наиболее часто встречаемый неродственный маркер при ОЛЛ – CD13.
- При ОМЛ коэкспрессия неродственных антигенов составила 73,6±3,9%. Наиболее часто встречаемый неродственный маркер при ОМЛ – CD19.
- Значительно реже в Казахстане выявлялся мегакариоцитарный вариант острого лейкоза (1 случай за 6 лет) в сравнении с Россией и странами Европы, что может свидетельствовать об особенностях острых лейкозов в нашей республике.
- Средняя интенсивность флюоресценции миеломаркеров CD14, CD13, CD117, CD33, MPO гораздо выше при специфической экспрессии при ОМЛ, чем выявляемых в качестве коэкспрессии при ОЛЛ. Аналогично, средняя интенсивность флюоресценции лимфомаркеров CD19, CD10, CD22, CD20 выше на бластных клетках ОЛЛ, чем ОМЛ.
Теги: иммунофенотипирование, острый лейкоз
Другие новости по теме:
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.
Посетители, находящиеся в группе Гости, не могут оставлять комментарии к данной публикации.