Этиологическая диагностика инфекционных заболеваний – важный сектор лабораторной медицины

То, что этиологическая диагностика инфекционных заболеваний человека является важным сегментом лабораторной медицины, определяется не только тем, что она осуществляется медицинскими лабораториями. Очевидность такого положения постоянно подтверждается все новыми фактами. В последние десятилетия мы все чаще лечим больных различными инфекционными заболеваниями не в инфекционных стационарах.

При соблюдении необходимого режима в таких стационарах лечат, например, больных инфекционными заболеваниями, возбудитель которых не передается от больного человека здоровому или пациенту с другими заболеваниями, что требует выполнения анализов для определения возбудителя.

В организационном плане реальность такова, что в терапевтических стационарах лечат даже больных с вирусными и бактериальными пневмониями, возбудители которых передаются контактным воздушно-капельным путем. В таких случаях неинфекционные стационары также должны заниматься этиологической диагностикой инфекционной патологии.

Международная классификация болезней, действующая до сегодняшнего дня, разделяет соматические, онкологические и инфекционные заболевания, хотя для все большего числа заболеваний, по классификации не отнесенных к инфекционным, уже установлены инфекционные агенты. Теперь известно, что возбудителем рака язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки является Helicobacter pylori, причиной гепатокарциномы – вирусы парентеральных гепатитов человека, для рака шейки матки практически в 100% случаев установлена этиологическая роль вирусов папилломы человека.

Рак многих других органов у женщин и мужчин в значительном проценте случаев также вызван папилломавирусами человека. Первооткрыватель этиологической роли папилломавирусов человека в развитии рака шейки матки доктор H. Hausen в 2012 г. сообщил, что на тот момент уже в 21% новых зарегистрированных в мире случаев рака установлена инфекционная природа. В известном и, казалось бы, шутливом выражении «Есть только инфекции и заболевания, инфекционной природы которых мы пока не знаем» велика и постоянно растет доля правды.

Каковы успехи и проблемы лабораторной диагностики инфекционных болезней?

Все больше осознается важность методологии в этиологической диагностике инфекций. В этом аспекте необходимо разделять принципы и технологии такой диагностики. Принципиально различные диагностические лабораторные подходы, известные сегодня, разнообразны: микро- и макроскопия биопроб для визуального опознания возбудителя, выделение потенциального возбудителя из биопроб с последующим определением его таксономически значимых характеристик; определение в биопробах фрагментов возбудителя (специфические для возбудителя фрагменты ДНК, РНК, таксономически значимые антигены и, возможно, ферменты и т.д.), определение физических характеристик возбудителя – обычно инфракрасный спектр; определение сопутствующих возбудителю других организмов (фаги), определение антигенспецифического (адаптивного) иммунного ответа человека на предполагаемый возбудитель (антитела, лимфоциты с рецепторами к таксономически значимому антигену).

Для большинства этих принципов разработано и применяется много технологий. При использовании методов выделения возбудителя используют различные среды для культивирования, что определяется особенностями потенциального возбудителя. Для определения фрагментов возбудителя применяют различные технологии ПЦР, различные серологические реакции (преципитации, многие варианты агглютинации, ИФА и др.) с использованием поли- или моноклональных сывороток и их применением в виде растворов или сорбированных препаратов, различные субстраты для соответствующих ферментов.

Для диагностики по адаптивному клеточному или гуморальному иммунному ответу применяют разнообразные серологические технологии с использованием таксономически значимых антигенов возбудителя в виде растворимых или чаще сорбированных иммунореагентов (агглютинационные тесты, ELISA (ИФА), ELISPOT и др.). Полностью осознана необходимость этапного принципа лабораторной диагностики, особенно при проведении скрининговых исследований. Арсенал принципов и технологий диагностики постоянно расширяется, разрабатываются новые приборы для автоматизации выполнения анализов и объективизации получаемых результатов, что уже обеспечило значительные успехи в диагностике инфекционных заболеваний.

Однако в сфере этиологической диагностики инфекционной патологии существуют и значительные проблемы. К основным из них нужно отнести: сложности дифференциации клинически выраженного заболевания и, так называемого, здорового носительства при исследовании ряда биопроб; необходимость дифференциального диагноза между инфекциями, вызванными возбудителями со сходными антигенами, особенно при сходной клинической симптоматике и использовании серологических тестов на антигены и антитела; сложности надежной иммунологической диагностики при беременности (особенно при использовании агглютинацинных тестов и РСК), отсутствие стандартных методов ранней этиологической диагностики. Серьезной проблемой остается отсутствие тесной связи клиники и лаборатории при разработке плана лабораторного обследования и интерпретации полученных лабораторных результатов.

Эти нерешенные проблемы снижают эффективность диагностики и, соответственно, качество лечения, а также точность и своевременность принятия противоэпидемических мер предупреждения распространения заболевания.

Необходимость дифференциации клинически выраженного заболевания и здорового носительства важна при принятии решения о лечении обследуемого. Однако, это затруднительно при выделении возбудителя ряда инфекций из фекалий (возбудители брюшного тифа, паратифов и др.), из зева (возбудители дифтерии, стафилококки, стрептококки) или из влагалища (возбудители ряда инфекций, передающихся половым путем) и т.п. Не всегда помогает даже оценка наличия или отсутствия клинической симптоматики, так как нередко заболевание протекает в стертой форме. Положительный результат ПЦР, полученный в мазках из влагалища, также не позволяет дифференцировать клинически выраженное заболевание и носительство некоторых возбудителей, передающихся половым путем.

Индикация антигенов потенциального возбудителя в фекалиях и даже в моче может быть результатом не текущей инфекции, а наступившего после нее реконвалесцентного периода и длится значительно дольше, чем принято считать для периода клинической реконвалесценции, что является результатом длительного периода элиминации антигенавозбудителя после перенесенной инфекции. Даже фрагменты ДНК возбудителя, определяемые методом ПЦР в мазках из влагалища, могут определяться дольше, чем наступает выздоровление от инфекции, передающейся половым путем.

Надежность дифференциальной диагностики инфекций, вызванных возбудителями с близкими по специфичности антигенами, видимо, можно преодолеть, если разработать для определения антител иммунодиагностические сорбированные препараты из рекомбинантных пептидов, специфичных только для одного из возбудителей.

Для определения антигенов с целью указанной дифференциации нужно разработать иммунные сыворотки против соответствующих рекомбинантных пептидов узкой таксономической специфичности или использовать специально выбранные гибридомы для получения соответствующих моноклональных сывороток. В том и другом случае такие препараты антител для агглютинацинных тестов или ИФА нужно сорбировать на носителе.

Для использования ПЦР с аналогичной целью при разработке диагностических тест-систем нужно подбирать праймеры, специфичные только для одного из возбудителей таких инфекций.

Диагностика этиологии инфекционного заболевания по регистрации иммунного антигенспецифического ответа на возбудитель только на первый взгляд кажется безукоризненным подходом. Для своевременного назначения адекватной этиотерапии результаты тестов на антитела всегда запаздывают: наиболее специфичные антитела, oсобенно IgG изотипа, появляются сравнительно поздно, тем более, что для надежной диагностики сыворотку предпочтительно исследовать в динамике – надежность диагноза по оценке нарастания активности антител у больного в течение заболевания существенно выше, чем при однократном выявлении условного диагностического уровня активности.

В результате запаздывания лабораторного результата на практике врач назначает лечение, ориентируясь в основном на клиническую симптоматику, в лучшем случае, с учетом эпидемиологических данных. Поэтому, а также потому, что результаты культуральных тестов тоже запаздывают, врачи вынуждены назначать пациенту антимикробные препараты широкого спектра действия, что ускоряет распространение в популяции резистентных штаммов и снижает в дальнейшем эффективность этиотропной терапии.

Обойти многие из отмеченных выше трудностей можно, используя некоторые, уже хорошо известные факты, и разрабатывая методы надежной ранней диагностики инфекционных заболеваний.

Специалисты знают, что надежность диагноза зависит от характера анализируемой биопробы. Например, если возбудитель брюшного тифа, паратифов выделен из фекалий (копрокультура), это не всегда клинически выраженная инфекция. Тот же результат может быть получен при обследовании носителя. Если возбудитель выделен из крови (гемокультура), это клинически выраженная инфекция. Если Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis или Haemophilus influenzae выделены из крови или ликвора, нужно диагностировать менингит соответствующей этиологии. Но выделение подобных возбудителей из зева может быть как при клинически выраженной инфекции, так и носительства.

Высокая доказательность выделения гемокультур для постановки надежного диагноза известна, но в практических лабораториях выделяют их не часто. Для повышения частоты выделения кровь у пациента нужно брать в начале острого заболевания, то есть при первой встрече с медработником и использовать для посева различные культуральные среды с учетом особенностей потенциальных возбудителей.

Методы ранней надежной диагностики по регистрации иммунного ответа должны быть направлены на использование технологий выявления лимфоцитов со специфическими рецепторами к потенциальному возбудителю. Это обусловлено тем, что эффекторный (антигенспецифический) ответ на антиген возбудителя начинается с формирования клеток со специфическими рецепторами к антигену. Необходимо широко изучать диагностические возможности обнаружения лимфоцитов с рецепторами для антигена как принципа ранней диагностики различных инфекционных заболеваний.

С этой целью в течение ряда лет в эксперименте и в клинике мы использовали принцип взаимодействия лимфоцитов с иммунореагентом (носитель, на котором сорбирован таксономически значимый антиген соответствующего возбудителя). Если лимфоцит имеет специфические рецепторы к антигену возбудителя (антигенсвязываюший лимфоцит – АСЛ), он связывает такой иммунореагент. АСЛ появляются раньше развития эффекторной фазы иммунного антигенспецифического ответа (антитела) и исчезают намного раньше исчезновения антител. Таким образом, выявление АСЛ является индикатором острого заболевания или обострения хронической инфекции. В таблице 1 приведен перечень инфекций, при которых в эксперименте и клинике изучена диагностическая эффективность такого теста для ранней диагностики.

Специфичность теста АСЛ доказана не только во многих экспериментах по отмене положительного результата гомо- и гетерологичными антигенами, но и при обследовании больных, в том числе по сопоставлению частоты выявления АСЛ при наличии/отсутствии определенных, но не строго патогномоничных клинических симптомов.

Чувствительность метода АСЛ при диагностике различных инфекций выше чувствительности обычных серологических реакций. Это показано при бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях.

При обследовании больных сифилисом обнаружено, что тест АСЛ обеспечивает, в отличие от реакций агглютинации (микрореакция), реакций связывания комплемента и даже РИФ, получение строго специфических результатов. Это обеспечивает надежную дифференциацию положительных и биологических ложноположительных результатов.

Возможность подобной дифференциации имеет важное значение для интерпретации результатов иммунодиагностического обследовании беременных не только на сифилис, но и на другие инфекции, например, бруцеллез (таблица 3) и определения на этой основе тактики ведения беременности.

Таким образом, выявление АСЛ важно для ранней этиологической диагностики инфекционных заболеваний, повышения специфичности этиологического диагноза и контроля эффективности лечения. Необходимо разрабатывать технологии определения АСЛ, доступные для практических лабораторий.

Из-за весьма вариантного течения инфекций (от здорового носительства до тяжелых форм клинически выраженной инфекции и ее хронизации), из-за многих факторов, значимых для каждого диагностического принципа и технологии получения диагностических реагентов (специфичность результата, чувствительность теста; зависимость результата от состояния обследованного, стадии заболевания и характера анализируемой биопробы; характеристика применяемых методов и препаратов при наличии точной информации в инструкции по применению; существование возбудителей различных заболеваний, но со сходными антигенами и т.д.) интерпретация лабораторных результатов во многих случаях и сегодня является непростой задачей. Чаще всего этим занимается врач-клиницист, сопоставляя лабораторные результаты с клинической характеристикой пациента. Но его компетенции часто недостаточно для точной интерпретации комплекса лабораторных данных.

Подготовка всех клиницистов, даже инфекционистов, для такой работы, как показывает опыт, вряд ли реальна. С нашей точки зрения, решить подобную задачу более реально, готовя врачей - клинических лаборантов широкого профиля. Это потребует серьезных организационных усилий для введения такой специальности и, что не менее обязательно, больших усилий для обеспечения качественной многопрофильной подготовки таких специалистов. Работа этих специалистов в многопрофильных медицинских учреждениях могла бы обеспечить более качественное планирование (совместно с клиницистом) лабораторного обследования и более точную интерпретацию комплекса лабораторных результатов.

Есть еще один важный организационный вопрос. Преподавание микробиологии и вирусологии на всех факультетах ведется в, основном, одинаково. Но будущим врачам лечебных профилей не обязательно знать детали технологии анализов, хотя совершенно необходимо быть хорошо информированными об особенностях микроорганизмов и принципах диагностических методов, их возможностях и ограничениях. Вводить такой материал на первых курсах, до подготовки на клинических кафедрах нецелесообразно. Сегодня есть понимание важности таких дисциплин как, например, клиническая фармакология, клиническая биохимия и т.д.

Поэтому в заключительные годы вузовской подготовки врачей-клиницистов было бы важно выделять время для преподавания основ клинической лабораторной диагностики. Вместе со штатным врачом клиническим лаборантом они обеспечили бы более надежное планирование лабораторного обследования пациента и интерпретацию комплекса лабораторных данных, что, в конечном счете, неизбежно должно привести к повышению качества лечения больных, а в случаях инфекционной патологии – и к обеспечению своевременного принятия противоэпидемических мер.