Линейный иммунный анализ (ЛИА) в диагностике аутоиммунных заболеваний

Линейный иммунный анализ (LIA) - линейный непрямой иммуногический анализ для качественного измерения аутоантител класса IgG (и/или IgА).

Компания HUMAN GmbH., Германия производит несколько видов LIA-тестов для определения аутоантител:

диагностика аутоиммунных заболеваний
• • LIA для определения антител при желудочно-кишечных заболеваниях IMTEC-Gastro-LIA,
• • LIA для определения антител при аутоиммунном миозите IMTEC-Myositis-LIA,
• • LIA для определения аутоантител при аутоиммунных заболеваниях печени IMTEC-Liver-LIA S,
• • LIA для определения антител при аутоиммунном васкулите IMTEC-Vasculitis-LIA,
• • LIA для определения антиядерных антител IMTEC-ANA-LIA (12 аутоантител),
• • LIA для определения антиядерных антител IMTEC-ANA-LIA Maxx (17 аутоантител).

Подробно рассмотрим ANA-LIA-Maxx, который представляет собой нитроцеллюлозную мембрану с 17 нанесенными антигенами для диагностики таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, синдром CREST, смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ), первичный билиарный цирроз, миозит. С данными заболеваниями могут быть связаны гломерулонефрит, РА, поражения ЦНС (психоз), анемия, лейкопения, нейтропения, легочный фиброз, неонатальная волчанка, инсульты, вызванные васкулитом.

Маркеры системной красной волчанки:

1. ds DNA (двуспиральная ДНК)

• • Антитела к ds DNA относятся к АЯА. С 1982 - один из 11 критериев системной красной волчанки (СКВ).
• • Обнаруживаются у 40-70% больных СКВ и указывают на активную фазу. Специфичность до 96%.
• • При успешном лечении титр снижается. Изменение концентрации позволяет предсказать рецидив заболевания.
• • Высокий риск развития волчаночного гломерулонефрита.
• • «Kлеточный фактор LE».

2. Nucleosome (нуклеосомы)

• • Антитела обнаруживаются у больных СКВ и ЛКВ.
• • Значительно раньше, чем к ds DNA – более чувствительный маркер.
• • У 84-88% больных СКВ, при этом у 16-30% больных СКВ с необразовавшимися еще антителами к ds DNA и к гистонам.
• • Редко при синдроме Шегрена и СЗСТ - 5-8%.
• • Развитие гломерулонефрита.

3. Histone (гистоны)

• • Гистоны — основной класс нуклеопротеинов, необходимых для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомы.
• • Антитела вырабатываются к димерам гистонов H2A и H2B.
• • Маркер для дифференциальной диагностики СКВ И ЛКВ: антитела обнаруживаются у 50-90% больных ЛКВ, при этом отсутствуют антитела к ds DNA.
• • При 20-50% случаев спонтанной СКВ.
• • Также можно обнаружить у больных первичным билиарным циррозом, РА, склеродермией, аутоиммунным гепатитом.

4. SmD1

• • Антиген Sm состоит из 9 различных полипептидов – белков snRNPs. Главная цель для антител - белок D1.
• • Высокоспецифичный маркер СКВ (94% специфичность) входит в критерии СКВ, принятые Американской ревматологической ассоциацией, и подтверждает диагноз СКВ.
• • Антитела обнаружены у 20-30% СКВ, часто в комбинации с антителами к U1-snRNP.
• • Уровень не отражает тяжесть заболевания.
• • Активная фаза заболевания, более агрессивное течение с поражением ЦНС и почек.

5. PCNA - proliferation cell nuclear antigen

• • Ядерный антиген пролиферирующих клеток - вспомогательный фактор ДНК-полимеразы во время репликации и репарации ДНК.
• • У 2-5% больных СКВ, но является важным клиническим маркером, так как наличие антител связанно с высокой частотой развития гломерулонефрита и тромбоцитопении.

6. P0 - ribosomal P phosphoproteins

• • Антитела к фосфоропротеинам рибосомального белка Р ингибируют взаимодействие факторов элонгации и рибосом, и также синтез белка в живых клетках.
• • Обнаруживаются у 10–20% больных СКВ.
• • При сильном поражении ЦНС – развитие волчаночного психоза.
• • Повышение концентрации антител коррелирует с эпизодами психоза.

Таким образом, маркеры системной красной волчанки:

• • Nucleosome – появляются значительно раньше, чем к ds DNA – более чувствительный маркер.
• • ds DNA - активная фаза, высокий риск развития волчаночного гломерулонефрита.
• • Histone - для дифференциальной диагностики СКВ И ЛКВ: обнаруживаются у 50-90% больных ЛКВ, при этом отсутствуют антитела к ds DNA.
• • SmD1 - активная фаза заболевания, более агрессивное течение, поражение ЦНС и почек.
• • P0 - при сильном поражении ЦНС – развитие волчаночного психоза.
• • PCNA - с высокой частотой развития гломерулонефрита и тромбоцитопении.

Маркеры синдрома Шегрена:

1. SS–A / Ro 60 kD и SS–A / Ro 52 kD

• • Антитела к антигену Ro/SS-A направлены на белки массой 52 кДа и 60 кДа, которые входят в состав сплайсосомы.
• • Антитела только к SS–A / Ro 60 kD обнаруживаются у больных СКВ (около 13%) с выраженной симптоматикой фотосенситивных кожных проявлений - «бабочка».
• • Антитела только к SS–A / Ro 52 kD обнаруживаются у больных первичным СШ.
• • Антитела к обоим протеинам образуются у больных СКВ и вторичном синдроме Шегрена.
• • Поражения легких, ЦНС, инсульты, вызванные васкулитом, почечная недостаточность.

2. SS–B / La

• • SS-B/La антиген является рибонуклеопротеином.
• • Более специфичный маркер СШ, на западе 50-60%, на востоке до 87%.
• • Обнаруживается у 10-15% больных СКВ и вторичным СШ.
• • В основном проявляется в комбинации с антителами к SS–A/ Ro 52 kD, что может прогнозировать развитие васкулита, лимфоаденопатии, спленомегалии, анемии и лейкопении.
• • Ассоциируется с низкой частотой развития нефрита.
• • При длительном заболевании СКВ во время активной фазы у 50-60% больных антитела к SS–В способствуют развитию нейтропении.
• • Антитела к dsDNA и белкам Р также могут способствовать нейтропении.

Маркеры склеродермии:

1. CENP-B - Centromere protein B

• • CENP-B - это ДНК-связывающий белок, который играет основную роль при формирование центромеры.
• • Антитела к CENP-B антигену разрушают организацию кинетохоров и вмешиваются в движение хромосом, этим останавливая деление клеток.
• • Высокоспецифичный маркер CREST-синдрома и лимитированной склеродермии: у 80-90% больных CREST были обнаружены антитела к CENP-B, в то время как у людей с ревматоидными болезнями, не имеющими отношения к CREST, анализ на антитела был отрицательным.

Антитела прогнозируют типичные проявления синдрома СREST, такие как:

• • Синдром Рейна с поражением пальцев и лица и только через длительное время (до 10 лет) - поражение внутренних органов.
• • Также наблюдается лимитированное поражение кожи и низкая вероятность развития легочного фиброза.

2. Scl-70 (scleroderma 70 kD)

• • Антитела к ДНК-топоизомеразе I, которая разрешает топологические проблемы, связанные со сверхспирализацией ДНК.
• • Показатель диффузной и прогрессирующей системной склеродермии, специфичность 90-100%.
• • Связаны с более усложненной формой заболевания.
• • У больных с антителами к Scl-70 наблюдается низкий уровень выживания с ранними и летальными поражениями почек и сердца.

Смешанное заболевание соединительной ткани:

1. U1-snRNP (small nuclear ribonucleoprotein complex)

• • U1 – один из 5 доменов сплайсосомы, около 70 кДа.
• • U1-snRNP необходим для сплайсинга мРНК и протекции транскриптома.

Если обнаружены антитела:

• • Только к U1-snRNP и отрицательно к SmD1 – указывает на СЗСТ, с классическими клиническими проявлениями заболевания (синдром Рейна, артрит, акросклероз, отек рук, миозит и легочная гипертензия).
• • И к U1-snRNP, и к SmD1 (или другие антитела СКВ) – классический СЗСТ разовьется в СКВ. Маркер нефрита, существующего или развивающегося. У 30-40% больных СКВ антитела образуются задолго до клинического проявления.
• • К U1-snRNP и PM-Scl - перекрестный синдром: системная склеродерма и ДМ/СКВ/СШ.
• • Сильная корреляция с болезнью легких и гломерулонефритом.

Первичный билиарный цирроз:

1. AMA M2 (anti-mitochondrial antibodies)

• • Митохондриальный антиген M2 является частью пируватдегидрогеназного комплекса, подготавливающий Ацетил-КоА для цикла трикарбоновых кислот (Кребса).
• • Находится на внутренней митохондриальной мембране и матриксе.
• • Высокоспецифичный маркер (90 - 95%) первичного билиарного цирроза.
• • У больных ПБЦ активированные Т-лимфоциты атакуют и разрушают эпителиальные клетки мелких желчных протоков, где экспрессия гена M2 происходит в больших количествах.
• • Из-за поврежденных желчных протоков происходит застой желчи в печени (холестаз), что приводит к рубцеванию, фиброзу, циррозу и печеночной недостаточности.
• • Высокий уровень ГГТ (GGT) подтверждает диагноз.

Миозит:

1. Jo-1

• • Маркер миозита и интерстициального заболевания легких.
• • Антитела к Jo-1 обнаружены у 33% больных с первичным полимиозитом и у 25% с первичным дерматомиозитом.
• • Часто при отсутствии основных ANA.
• • Высока вероятность развития полимиозита в хроническую и деформирующую форму заболевания.
• • Повышение уровня креатинкиназы подтверждает диагностику.
• • Анти-Jo-1-антитела направлены на гистидин–тРНК–синтетазу.
• • Признаки «Синдрома антисинтетазы» - синдром Рейна, полиартралгия или полиартрит, а также одышка.
• • Клетки легких особо обогащены этим ферментом, который локализируется в альвеолярном эпителии. Эти клетки - изначальные мишени для анти-Jo-1- антител, в то время как мышцы поражаются в более поздние стадии заболевания.

2. PM-Scl (polymyositis – scleroderma)

• • PM-Scl – комплекс из 10 ядрышковых антигенов – части комплекса РНК-экзосомы.
• • РНК-экзосома участвует в надлежащем развитии стабильных видов РНК и уничтожении побочных продуктов (некодирующие регионы, транскрипты с дефектами).
• • Высокоспецифичный маркер перекрестного синдрома склеродермии - полимиозита (ДМ).
• • Также, но реже, - маркер системной склеродермии.
• • Пациенты с анти -PM-Scl-антителами страдают язвами на подушечках пальцев и надкостными выступами, контрактурами суставов и атрофией мышц.
• • 55% пациентов также имеют фиброз легких и рестриктивный легочный процесс. Наблюдается значительное повышение креатинкиназы, но очень редко поражение желудочно-кишечного тракта и почек.

3. Mi-2 (β)

• • Mi-2-антиген является компонентом нуклеосом ремоделинг деацетилазы.
• • Антитела к Mi-2-антигену - серологический признак идиопатической воспалительной миопатии.
• • Специфичность более 96%. Антитела к Mi-2 находят у 10-15% больных с острым дерматомиозитом.
• • Клинические проявления: артралгия, синдром Рейна, артрит, интерстициальное заболевание легких, но не сердечная недостаточность.
• • При наличии антител к Mi-2 (β) высока вероятность развития злокачественного поражения, вызванного дерматомиозитом, и в дальнейшем рака (яичников, легких, поджелудочной железы, желудка, колоректального, лимфома нон-Ходжкин).

4. Ku

• • Ku-антиген – регулирующий компонент протеинкиназы, связанной с ДНК, которая фосфорилирует ДНК-полимеразу II и некоторые транскрипционные факторы.
• • Белки Ku важны для транскрипции гена U1-snRNP.
• • Ku-антитела содействуют развитию множественных аутоиммунных состояний. Антитела к Ku обнаружены у 5-25% пациентов с перекрестным синдромом склеродермии – полимиозитом.
• • Около 7% больных миозитом.
• • Также антитела к Ku образуются при легочной гипертензии на фоне склеродермии, при СКВ и первичном СШ.
• • Клинические проявления: артралгия, миозит, синдром Рейна.
• • Антитела к Ku не связанны с развитием рака при дерматомиозите.
• • Часто проявляются вместе с основными ANA (анти-Ro/SS-A, U1-snRNP).

Интерпретация ЛИА-тестов проводится с помощью входящего в набор прозрачного оценочного шаблона и исключительно на основе соответствующего cut-off-контроля, учитываемого для каждого стрипа (24 стрипа в наборе). Результат теста отрицательный, если ни одна из полос не распознана или если полоса демонстрирует меньшую интенсивность по сравнению с cut-off-контролем. Тест сомнительный, если интенсивность полосы и интенсивность cut-off-контроля сильно не отличаются. Результат теста положительный, если полоса демонстрирует более сильное окрашивание по сравнению с cut-off-контролем. Соответствующие результаты теста записываются в оценочный лист. Метод бесприборный, но для автоматизации метода, объективной оценки результатов, архивирования данных может быть использовано специализированное программное обеспечение HumaScan и сканер планшетного типа с минимальным разрешением 300 точек на дюйм.

Таким образом, представленные ЛИА-тесты могут использоваться для скрининга и ранней диагностики аутоиммунных заболеваний.